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Was ist eine Phasenkontrastmikroskopie?

Die Phasenkontrastmikroskopie ist eine Art der optischen Mikroskopie, bei der die Phasendifferenz des Lichts in einen Kontrast für die Beobachtung umgewandelt wird.

Bei der gewöhnlichen optischen Mikroskopie werden Unterschiede in den Reflexions- und Absorptionsspektren des Lichts von verschiedenen Teilen einer Probe als Helligkeits- oder Farbunterschiede (Kontrast) beobachtet. Bei der Betrachtung von nahezu transparenten, farblosen Materialien wie lebenden Zellen, Mikroorganismen und Bakterien sind diese Kontraste jedoch fast nicht vorhanden und Informationen wie die Form können nicht ermittelt werden.

Selbst farblose, transparente Materialien können an ihren Grenzen Lichtbeugung verursachen, wenn sich ihr Brechungsindex von dem ihrer Umgebung unterscheidet. Die Phasenkontrastmikroskopie nutzt die Phasendifferenz zwischen dem gebeugten Licht und dem Licht, das gerade durch das Material läuft, um einen Kontrast zwischen hell und dunkel zu erzeugen, der die Beobachtung farbloser, transparenter Materialien ermöglicht.

Anwendungen der Phasenkontrastmikroskopie

Phasenkontrastmikroskope werden in der Biologie und Medizin häufig zur Beobachtung von Zellkulturen und für klinische Untersuchungen eingesetzt. Die Untersuchung von Parodontitis-Bakterien in Zahnkliniken ist eine der Allgemeinheit bekannte Anwendung. Sie trägt dazu bei, Patienten zu motivieren, sich besser um ihre Mundgesundheit zu kümmern, indem sie ihnen den Zustand ihrer eigenen Mundbakterien bewusst macht.

Die Phasenkontrastmikroskopie ermöglicht die Beobachtung lebender Zellen, ohne dass die Probe angefärbt werden muss. Bei der Betrachtung farbloser Zellen mit einem herkömmlichen Lichtmikroskop wird die Probe zur Beobachtung angefärbt. Diese Methode hat jedoch den Nachteil, dass das Anfärben zeitaufwändig ist und lebende Zellen abtötet.

Die Phasenkontrastmikroskopie eignet sich auch für die Analyse der giftigen Substanz Asbest. Es gibt mehrere Methoden zur Analyse von Asbest. Eine dieser Methoden ist die Dispersionsfärbemethode, bei der Kristalle in einer Immersionslösung mit einem bestimmten Brechungsindex unter einem Phasenkontrastmikroskop mit polarisiertem Licht bestrahlt werden und anhand der entstehenden Farbe festgestellt wird, ob es sich um Asbest handelt oder nicht.

Funktionsweise der Phasenkontrastmikroskopie

In einem Phasenkontrastmikroskop wird eine Phasenplatte nur an der Stelle eingesetzt, an der das direkte Licht zwischen Objektiv und Bildebene hindurchtritt, um die Phase des direkten Lichts um 1/4λ vor- oder zurückzustellen. Gleichzeitig wird ein ringförmiger ND-Filter eingesetzt, um die Intensität des direkten Lichts zu verringern, ohne jedoch die Phase oder Helligkeit des gebeugten Lichts zu verändern.

Durch diese Vorgänge wird die Phasendifferenz zwischen dem direkten Licht und dem gebeugten Licht 1/2 λ oder 0 und die Hell-Dunkel-Kontraste werden durch Interferenz erzeugt.

Mit anderen Worten: Der Bereich der plötzlichen Änderung des Brechungsindex, in dem gebeugtes Licht erzeugt wird, erscheint dunkel, weil das direkte Licht und das gebeugte Licht so miteinander interferieren, dass sie sich gegenseitig abschwächen, wenn die Phasendifferenz 1/2 λ beträgt. Dies ist der Dunkelkontrast. Ist die Phasendifferenz dagegen 0, erscheint die Stelle der abrupten Brechungsindexänderung hell, weil das direkte und das gebeugte Licht einander verstärkend überlagern. Dies ist der helle Kontrast.

Weitere Informationen zur Phasenkontrastmikroskopie

1. Probleme bei der optischen Mikroskopie

Bei der herkömmlichen Lichtmikroskopie lässt sich eine Substanz anhand von Unterschieden in der Intensität (Amplitude) und der Farbe (Wellenlänge) des durch die beobachtete Substanz durchgelassenen Lichts erkennen. Daher ist es zum Beispiel nicht einfach, den Unterschied oder die Grenze zwischen einer farblosen transparenten Substanz A und einer farblosen transparenten Substanz B zu erkennen, die mit einer farblosen transparenten Substanz A in Kontakt steht, selbst wenn sie mit einem gewöhnlichen Lichtmikroskop beobachtet werden.

Dies liegt daran, dass es keinen Unterschied in der Intensität und Farbe des durchgelassenen Lichts und keinen Kontrast zwischen A und B gibt. Unterscheiden sich jedoch die Brechungsindizes der Substanzen A und B, so wird das Licht an der Grenze zwischen ihnen in direktes Licht, das gerade durch die Probe hindurchgeht, und gebeugtes Licht, dessen Weg sich ändert, aufgeteilt. Da gebeugtes Licht dort entsteht, wo sich der Brechungsindex abrupt ändert, enthält es Informationen über die Grenzform und die innere Struktur der einzelnen Substanzen in der Probe.

Es ist wichtig zu wissen, dass gebeugtes Licht im Vergleich zu direktem Licht, das gerade durch die Probe läuft, um ein Viertel einer Wellenlänge (λ) (1/4 λ) verzögert ist. Eine solche Verzögerung um einen Bruchteil einer Wellenlänge wird als Phasendifferenz bezeichnet. Selbst wenn gebeugtes Licht erzeugt wird, ist die Phasendifferenz gering, da sie im Vergleich zum direkten Licht schwach ist.

Daher hat das resultierende Bildlicht, das die Summe aus direktem und gebeugtem Licht ist, eine Wellenform, die der des direkten Lichts ähnelt und bei der gewöhnlichen optischen Mikroskopie wird kein Kontrast zwischen hell und dunkel erzeugt.

2. Unterschied zwischen Phasenkontrast- und Differentialinterferenzmikroskopie

Neben der Phasenkontrast- ist die Differenzialinterferenzmikroskopie ein weiterer Mikroskopietyp, bei dem der Kontrast durch Lichtinterferenz erzeugt wird. Bei der differentiellen Interferenzmikroskopie wird das auf die Probe auftreffende Licht in zwei Polarisationen mit leicht unterschiedlichen Wegen aufgeteilt und die beiden Lichter interferieren miteinander, nachdem sie das Beobachtungsobjekt passiert haben, um einen Kontrast zu erhalten.

Sie ähnelt der Phasenkontrastmikroskopie insofern, als sie die Beobachtung unmöglich farbloser und transparenter Materialien ermöglicht. Während die Phasenkontrastmikroskopie jedoch einen Kontrast in Bereichen liefert, in denen sich der Brechungsindex der Probe abrupt ändert, liefert die differentielle Interferenzmikroskopie einen Kontrast in Bereichen, in denen ein Gradient in der Dicke oder im Brechungsindex der Probe vorhanden ist.